Doktorarbeit
Doppelt Stimuli-Sensitive Polymer- und Hybridsysteme: Anwendungen für den Gentransfer und Hydrogele
Alexander Majewski (09/2013)
Betreuer: Axel H. E. Müller
Kurzfassung
Die vorliegende Dissertation basiert vorwiegend auf der Synthese funktioneller, wasserlöslicher und stimuli-sensitiven Polymeren unter der Verwendung von Poly((2-dimethylamino)ethylmethacrylat) (PDMAEMA). PDMAEMA zeigt ein doppelt stimuli-sensitives Verhalten und besitzt polykationischen Charakter unter physiologischen Bedingungen. Dies führt zu herausragenden Eigenschaften und einer vielseitig einsetzbaren Komponente für wasserbasierende Anwendungen. Der Hauptaspekt dieser Dissertation war es die Fähigkeiten des PDMAEMAs für den Gentransfer mit den magnetischen Eigenschaften von Eisenoxid-Nanopartikeln zu kombinieren, um dadurch einen Genvektor zu erhalten, der auf ein externes magnetisches Feld anspricht. Ein weiteres Ziel war es die doppelte Sensitivität zu äußeren Reizen (Temperatur und pH) von PDMAEMA für physikalisch vernetzte Gele anzuwenden. Erste Ergebnisse auf dem Gebiet der magnetischen doppelt stimuli-sensitiven Genvektoren führten zu einer vergleichsweise einfachen Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln mit aufgepfropften PDMAEMA unter der Verwendung von Dopamin als physikalisch adsorbierende Ankergruppe der Polymerketten. Hierfür wurde ein Dopamin-Derivat für die Oberflächenmodifikation der Eisenoxid-Nanopartikel verwendet, welches eine ATRP-Initiatorgruppe trägt. Dadurch war es möglich DMAEMA kontrolliert radikalisch von der Oberfläche aus („grafting-from“) zu polymerisieren. Gentransfer-Experimente mit CHO-K1 Zellen zeigten, dass die Transfektionseffizienz wesentlich höher ist als bei Polyethylenimin (PEI), das als der „goldene Standard“ unter den polykationischen Polymeren gehandelt wird. Die Hybrid-Partikel besitzen ein relativ hohes Molekulargewicht (4,3 MDa), was eine hohe Zytotoxizität schlussfolgern lässt, wie es bei linearen PDMAEMA der Fall ist. Jedoch ist die Zytotoxizität auffallend gering, sogar geringer als die von PEI. Dadurch kann die exzellente Darbietung in den Gentransfer-Experimenten der sternähnlichen Struktur des PDMAEMAs zugeschrieben werden. Des Weiteren ermöglichte die Aufnahme unseres superparamagnetischen Genvektors in die Zellen eine magnetische Zelltrennung unter der Verwendung eines externen magnetischen Felds. Aufgrund der nicht kovalenten Bindung der Dopamin-Ankergruppe an die Eisenoxid-Nanopartikel löst sich ein Teil der PDMAEMA-Ketten mit der Zeit von der Oberfläche ab. Daher wurden in einem nächsten Schritt magnetische Kern-Schale-Korona Nanopartikel synthetisiert, wobei die Korona wiederum aus PDMAEMA besteht. Um Zugang zu dieser komplexeren Struktur zu erhalten, wurden die Nanopartikel mit einer dünnen Silica-Schale ummantelt, auf die in einem folgenden Schritt mittels Silan-Chemie die PDMAEMA-Ketten kovalent angebunden werden konnten. Dadurch entstanden dauerhaft stabile doppelt stimuli-sensitive Hybrid-Nanopartikel, welche keine Freisetzung der PDMAEMA-Ketten von der Nanopartikeloberfläche mehr aufwiesen und zudem auch eine hohe Langzeitstabilität in wässrigem Medium besitzen. Diese sternähnlichen Hybridpartikel zeigten exzellente Ergebnisse bei Gentransfer-Experimenten. Die Entstehung von Inter-Polyelektrolyt-Komplexen zwischen der PDMAEMA-Korona der Kern-Schale-Korona Partikel und pDNA zeigten, dass bei den N/P-Verhältnissen (Polymer Stickstoff / pDNA Phosphor), bei denen die besten Transfektionsergebnisse erzielt worden sind, jeweils ein pDNA Molekül pro Nanopartikel komplexiert wird. Die magnetische Zelltrennung wurde weiterentwickelt, indem ein magnetisch aktiviertes Zelltrennungssystem (Magnetic Activated Cell Sorting system (MACSTM)) angewendet wurde. Die magnetisch abgetrennten Zellen behielten ihre hohe Transfektionseffizienz, sowie hohe Viabilität. Zudem war eine weitere Kultivierung dieser Zellen möglich. Ein weiterer Bestandteil der Dissertation war es PDMAEMA als stimuli-sensitiven Block in ein doppelt schaltbares Blockcopolymer-Hydrogel zu integrieren. Für diesen Zweck hatten wir uns für ein physikalisch vernetztes ABCBA Pentablockterpolymer-System entschieden. Dieses wurde mittels sequentieller ATRP polymerisiert und besteht aus einem wasserlöslichen Polyethylenoxid (PEO) Mittelblock, zwei doppelt stimuli-sensitiven (Temperatur/pH) PDMAEMA B-Blöcken, sowie zwei thermo-sensitiven Poly((diethylenglycol)methylethermethacrylat) (PDEGMA) A-Blöcken (PDEGMA-b-PDMAEMA-b-PEO-b-PDMAEMA-b-PDEGMA). Das Aggregationsverhalten wurde in verdünnten Lösungen durch temperaturabhängige dynamische Lichtstreu-Experimente (DLS) bestimmt, wobei gezeigt werden konnte, dass beide stimuli-sensitive Blöcke unabhängig voneinander geschalten werden können und dass die Knäuel-Globulus-Übergangstemperaturen dieser Blöcke stark von der Blocklänge für niedrige Molekulargewichte abhängig ist. Rheologieuntersuchungen von konzentrierten Lösungen konnten jedoch keine weitere Änderung der mechanischen Eigenschaften des Hydrogels nach dem Gelieren für die untersuchten ABCBA Pentablockterpolymer-Zusammensetzungen ermitteln. Dies führt zum Ergebnis, dass das Prinzip unseres komplexen Systems auf eine erfolgreiche Synthese von doppelt stimuli-sensitiven ABCBA Pentablockterpolymer-Hydrogelen hindeutet, welche sogar zwei deutliche Phasenübergänge für den Gelzustand zeigen könnten, wenn größere Blocklängen für die äußeren A- und B-Blöcke verwendet würden.